一、基本概念和術(shù)語(yǔ)
1．色譜圖和峰參數(shù)
?色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線(xiàn)，又稱(chēng)色譜流出曲線(xiàn)(elution profile)。
?基線(xiàn)(base line)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線(xiàn)。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。
?噪音(noise)——基線(xiàn)信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
?漂移(drift)——基線(xiàn)隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。
?色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線(xiàn)。流出曲線(xiàn)上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱(chēng)形正態(tài)分布曲線(xiàn)（高斯Gauss曲線(xiàn)）。不對(duì)稱(chēng)色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見(jiàn)。
?拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對(duì)稱(chēng)性。也稱(chēng)為對(duì)稱(chēng)因子(symmetry factor)或不對(duì)稱(chēng)因子(asymmetry factor)。《中國(guó)藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
?峰底——基線(xiàn)上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。
?峰高(peak height，h)——峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。
?峰寬(peak width，W)——峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線(xiàn)與基線(xiàn)的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W＝4σ
?半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
?標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，σ)——正態(tài)分布曲線(xiàn)x＝±1時(shí)（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱過(guò)程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
?峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h
2．定性參數(shù)（保留值）
?死時(shí)間(dead time，t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過(guò)色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來(lái)測(cè)定死時(shí)間。
?死體積(dead volume，V0)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
?保留時(shí)間(retention time，tR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。
?保留體積(retention volume，VR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱(chēng)洗脫體積。VR＝F×tR
?調(diào)整保留時(shí)間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱(chēng)折合保留時(shí)間(reduced retention time)。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
?調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
3．柱效參數(shù)
?理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱(chēng)柱效）。
N取決于固定相的種類(lèi)、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種類(lèi)和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對(duì)稱(chēng)并符合正態(tài)分布，N可近似表示為：
N＝()2＝16()2＝5.54()2
N為常量時(shí)，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。
N與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱長(zhǎng)為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱(chēng)為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。
?理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長(zhǎng)的方差。H＝。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長(zhǎng)L和理論塔板數(shù)計(jì)算：H＝，H有效＝。
4．相平衡參數(shù)
?分配系數(shù)(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。K＝。
分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù) （或稱(chēng)交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來(lái)表示。
在條件（流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時(shí)（Cs、Cm很小）時(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無(wú)關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。
?容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱(chēng)質(zhì)量分配系數(shù)。
分配系數(shù)、容量因子與保留時(shí)間之間有如下關(guān)系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說(shuō)明容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（t'R）是不保留組分保留時(shí)間（t0）的幾倍。k＝0時(shí)，化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說(shuō)明固定相對(duì)此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)。
容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無(wú)關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測(cè)定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。
?選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α＝＝ （設(shè)k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱(chēng)為相對(duì)保留時(shí)間（《美國(guó)藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無(wú)關(guān)。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。
5．分離參數(shù)
?分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當(dāng)W1＝W2時(shí)，R＝。當(dāng)R＝1時(shí)，稱(chēng)為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R＝1.5時(shí)，稱(chēng)為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱(chēng)為完全分離。《中國(guó)藥典》規(guī)定R應(yīng)大于1.5。
?基本分離方程——分離度與三個(gè)色譜基本參數(shù)有如下關(guān)系：
R＝××
其中稱(chēng)為柱效項(xiàng)，為柱選擇性項(xiàng)，為柱容量項(xiàng)。柱效項(xiàng)與色譜過(guò)程動(dòng)力學(xué)特性有關(guān)，后兩項(xiàng)與色譜過(guò)程熱力學(xué)因素有關(guān)。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當(dāng)α＝1時(shí)，R＝0，無(wú)論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來(lái)改變選擇性：a. 改變流動(dòng)相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃印＿@常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k2在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1．塔板理論的基本假設(shè)
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過(guò)程看成在分餾塔中的分餾過(guò)程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過(guò)程。塔板理論的基本假設(shè)為：
1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。
2） 樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。
3） 流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。
4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無(wú)關(guān)。
雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過(guò)程不符，如色譜過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線(xiàn)方程，成功地解釋了流出曲線(xiàn)的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評(píng)價(jià)色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線(xiàn)方程及定量參數(shù)（峰高h(yuǎn)和峰面積A）
根據(jù)塔板理論，流出曲線(xiàn)可用下述正態(tài)分布方程來(lái)描述：
C＝e 或 C＝e
由色譜流出曲線(xiàn)方程可知：當(dāng)t＝tR時(shí)，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說(shuō)明：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)（即σ一定），峰高h(yuǎn)與組分的量C0（進(jìn)樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線(xiàn)方程對(duì)V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0。可見(jiàn)A相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C0，因此是常用的定量參數(shù)。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計(jì)算公式。
三、速率理論（又稱(chēng)隨機(jī)模型理論）
1．液相色譜速率方程
1956年荷蘭學(xué)者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來(lái)，提出了色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。它把色譜過(guò)程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過(guò)程，研究過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。
后來(lái)Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱(chēng)氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f
2．影響柱效的因素
1）渦流擴(kuò)散（eddy diffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會(huì)使柱壓過(guò)高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小。總的說(shuō)來(lái)，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無(wú)填料，A＝0。
2）分子擴(kuò)散（molecular diffusion）。又稱(chēng)縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u＝2γDm/u。u為流動(dòng)相線(xiàn)速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長(zhǎng)（u小），展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的影響較大。Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話(huà)，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對(duì)Dm進(jìn)行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細(xì)管柱的γ＝1。
3）傳質(zhì)阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)過(guò)程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過(guò)程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時(shí)間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu又分為三項(xiàng)。
①流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來(lái)得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。
②靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對(duì)峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過(guò)程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。高柱溫可以增大Dm，但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質(zhì)阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹(shù)脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí)Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進(jìn)樣時(shí)間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過(guò)程。過(guò)高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當(dāng)?shù)牧魉佟Ｒ訦對(duì)u作圖，則有一最佳線(xiàn)速度uopt，在此線(xiàn)速度時(shí)，H最小。一般在液相色譜中，uopt很小（大約0.03~0.1mm/s），在這樣的線(xiàn)速度下分析樣品需要很長(zhǎng)時(shí)間，一般來(lái)說(shuō)都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測(cè)器死體積。
3．柱外效應(yīng)
速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應(yīng)（色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱內(nèi)＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測(cè)池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對(duì)接宜呈流線(xiàn)形，檢測(cè)器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。研究表明柱外死體積之和應(yīng)＜VR/。其次，希望將樣品直接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體積≤VR/2。
柱外效應(yīng)的直觀(guān)標(biāo)志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時(shí)，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影響相對(duì)較小。